Требования к забору и подготовке биологического материала для проведения гематологических исследований.

Требования к транспортировке и хранению биологического материала для проведения гематологических исследований.

Правильное заполнение направления на исследование системы гемостаза:

Ф.И.О., возраст, пол пациента

Время забора крови для исследования

Клинический диагноз (кратко)

Гематокрит

Геморрагический синдром (носовые, маточные кровотечения и др.), тромбоз (указать локализацию), шок, полиорганная недостаточность, травмы, синдром длительного сдавления, ожог и др.)

Указать принимаемые лекарства, влияющие на параметры гемостаза с указание дозировки, способа и срока последнего введения

Соблюдаются временной интервал забора образца (крови), диетические и нагрузочные органичения:

Плановый забор крови проводят с 7 до 9 часов утра, в положении пациента лежа или сидя. При исследовании гемостаза в динамике забор крови желательно проводить в том же положении тела, что и предыдущий забор.

Кровь берут натощак, через 12-14 часов после последнего приема пищи.

Перед забором крови желателен отдых пациента в течение 15 минут.

Исключения: исследования гемостаза по cito, оценка АЧТВ.

Накануне планового исследования (в течение 24 часов) пациент воздерживается от значительных физических нагрузок, приема алкоголя. Желательно, чтобы накануне забора крови пациент не употреблял жирной пищи.

Оперативное вмешательство приводит к изменению показателей гемостаза на срок от нескольких дне до нескольких недель.

К факторам, влияющим е гемостаз относятся инъекции, вливания, переливания, пункции, биопсии, массаж, диализ, введение рентгеноконтрастных средств, иммуносцинтиография, иоизирующее излучение, эндоскопическое исследование, специальные диеты.

ПРАВИЛА ЗАБОРА КРОВИ

Кровь берут из периферической вены(чаще локтевой).

Забор крови производится только с использованием вакуумной системы забора в пробирки со специальной цветовой маркировкой в зависимости от используемого антикоагулянта (цитрат натрия 3,2%) в соотношении: 1 объем цитрата натрия к 9 объемам крови.

Для исследования уровня тромбоцитов кровь берут в пробирку с ЭДТА (сиреневая цветовая маркировка). Исследование уровня тромбоцитов назначают при отсутствии клинического анализа крови либо при получении в клиническом анализе крови патологических значений уровня тромбоцитов

Допустимо кратковременное наложение жгута, не более чем на 60 секунд. Жгут снимите сразу после того, как игла вошла в вену. Для забора крови на исследование свертывающей системы важно, что нельзя массировать вены, стучать по ним.

Используйте иглу для забора крови с внутренним диаметром 0,7-1 мм (размер 19-22).

Использование шприца недопустимо из-за активации тромбоцитов и факторов свертывания крови турбулентным движением крови и ее смешивания с воздухом (вспенивания). Оно исключается при использование вакуумных контейнеров.

После введения иглы в вену присоедините вакуумный контейнер, кровь начнет поступать в контейнер самотеком.

Кровь для коагулологического исследования берите во вторую пробирку, первую используйте для других исследований, например, биохимических. Если первой должна быть набрана пробирка, предназначенная для исследования свертывающей системы, первые 5 мл крови наберите в пустую пробирку и выбросьте, чтобы предотвратить попадание в пробу тканевого тромбопластина.

Кровь немедленно после взятия аккуратно перемешайте без вспе­нивания с антикоагулянтом (переверните пробирку 3-4 раза).

После забора биологического материала проверьте образец крови. Аккуратная проверка образцов крови позволяет избежать следующих ошибок: неправильное соотношение объемов кровь/цитрат; частично свернувшаяся кровь.

Кровь доставляют в лабораторию в течение 45 минут после ее забора. При транспортировке кровь нельзя сотрясать. Нельзя допускать транспортировку образцов крови при температуре меньше 4°С и выше 30°С.

Фельдшер-лаборант (медицинский технолог) осуществляет:

входной контроль доставленной крови, включающий: 1)проверку правильности заполнения направительного бланка. 2) проверку достаточности доставленного объема крови по метке на пробирке, 3)проверку образца на отсутствие сгустков при медленном наклоне пробирки.

центрифугирование доставленной крови с целью получения:

богатой тромбоцитами плазмы (параметры центрифугирования: число оборотов в минуту = 1000 об/мин (около 150-200g), время центрифугирования 5-7 минут.

Для выбора оптимальных условий центрифугирования ориентируются на центробежную силу (g). Можно воспользоваться фор­мулой:

g = 1,118 х 0,00001r х n2,

где г - радиус центрифуги - расстояние в сантиметрах между осью ротора и центром пробирки в гнезде центрифуги; п - число обо­ротов в минуту.

бедной тромбоцитами плазмы (параметры центрифугирования: число оборотов в минуту = ~2500-3000 об/мин (около 1500-2000g), время центрифугирования 10-20 минут. Для полного удаления тромбоцитов проводится повторное центрифугирование, параметры центрифугирования остаются прежними.

3. После центрифугирования проверяет плазму на цвет и прозрачность: гемолизированный образец, иктерическая или липемическая (хилезная) плазма исследованию не подлежат.

После центрифугирования отбирает супернатант.

Желательно исследовать показатели гемостаза в течение 2 часов после взятия крови , но допускается исследование коагулологических показателей в течение 4 часов , если плазма была отделена от осадка эритроцитов и лейкоцитов.

При необходимости длительного хранения «свежие» пробы (не позже 2 часов после забора крови) бестромбоцитной плазмы можно однократно заморозить и хранить до 2 недель при температуре -20°С или до 6 месяцев при температуре -70°С. Размораживать плазму надо быстро в теплой воде (+36°С), тщательно перемешать и немедленно исследовать. После замораживания возможно изменение АЧТВ.

Методика приготовления микропрепаратов для гематологических исследований, методы фиксации и окраски.

Методика приготовления мазков крови для гематологических исследований.

Подготовка и обработка стекол. Новые чистые стекла могут использоваться после обезжиривания в смеси Никифорова (равные части 96% этилового спирта и эфира). Использованные стекла замачиваются в течение суток в теплом мыльном растворе или растворе стирального порошка (1 столовая ложка порошка на 5 л воды). Через сутки раствор сливают, стекла промывают проточной водой. Затем их снова заливают теплым мыльным раствором или раствором стирального порошка и доводят до кипения, кипятят в этом же растворе 5-10 мин (не более, во избежание помутнения стекол). После охлаждения раствора его снова сливают, прополаскивают стекла проточной водой и каждое стекло промывают щеткой под проточной водой. Обработанные таким образом стекла раскладывают на чистой простыне для высыхания. Чистые стекла для обезжиривания помещают в смесь Никифорова или 96% этиловый спирт на 60 мин, затем вытирают насухо и хранят в чистой посуде с широким горлом. Чистые стекла рекомендуется брать либо пинцетом, либо руками за боковые края.

Приготовление мазков. На сухое подготовленное предметное стекло ближе к короткой стороне наносят стеклянной палочкой (или непосредственно из места укола пальца) небольшую каплю крови. Оставляют стекло в горизонтальном положении и размазывают кровь по стеклу с помощью сухого чистого шлифованного стекла, держа его под углом 45°. Коротким ребром, подождав, пока вся кровь не расплывется по нему, быстро проводят по предметному стеклу. Сильно нажимать на предметное стекло не следует, так как это может привести к повреждению форменных элементов крови. Мазки высушивают на воздухе и маркируют (лучше простым карандашом). Высохший мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, достаточной величины, располагаться на расстоянии 1,0-1,5 см от краев стекла, занимать почти всю длину стекла и заканчиваться «метелочкой». Толстые (густо-розового цвета) мазки использовать не следует, так как в них морфология клеток трудноразличима.

Стандартные качественные мазки получаются при использовании автоматических устройств, предназначенных для приготовления мазков и выпускаемых различными фирмами.

Фиксация и окраска мазков крови. Перед окраской мазки крови обычно фиксируют 5–10 мин в метиловом спирте для предотвращения гемолиза, который может произойти при контакте с водой в процессе окрашивания водорастворимой краской или при последующем контакте с водой. Методики фиксации описаны ниже вместе с методиками окраски. Для окраски по Райту и Лейшману фиксация не требуется, так как эти краски содержат метиловый спирт.

Сухие мазки могут храниться в течение 2 дней в сухом теплом месте, в жаркой влажной атмосфере без фиксации они хранятся значительно меньше.

Клетки крови содержат базофильные и ацидофильные структуры, различающиеся по реакции (pH). Ядра являются базофильными и окрашиваются в голубой цвет. Высоко базофильные (кислые) гранулы базофила также синие. Гемоглобин (будучи основным) окрашивается ацидофильно, т. е. в красный цвет. Окраска с помощью комбинации кислых и основных красителей называется окраской по Романовскому и имеет различные модификации (Паппенгейма, Райта, Нохта, Лейшмана, Гимзы, Джейнера и др.). В качестве основного красителя, как правило, используется метиленовый синий, но также применяется и толуидиновый синий. В качестве кислого красителя используются эозин, азур I и азур II.

Критерии хорошей окраски: розовый цвет эритроцитов, фиолетовое окрашивание зернистости нейтрофилов на розовом фоне, нежная азурофильная зернистость моноцитов.

Для разведения краски лучше всего использовать нейтральную свежую дистиллированную воду. Несвежая дистиллированная вода становится кислой из-за захвата углекислого газа из атмосферы. Если дистиллированная вода имеет щелочную реакцию, эритроциты окрашиваются в грязный голубовато-зеленый цвет; та часть лейкоцитов, которая должна окрашиваться голубым цветом, приобретает фиолетовый оттенок, гранулы эозинофилов становятся голубоватыми и зеленоватыми вместо розовых, а гранулы нейтрофилов перекрашиваются. При кислой воде эритроциты окрашиваются в ярко-оранжевый цвет, а ядра лейкоцитов очень бледные. Идеальной является дистиллированная вода с pH 7,0, для сохранения которой применяется ее забуферивание. Можно использовать готовые к употреблению буферные таблетки, растворяемые в дистиллированной воде.

Для окраски мазков костного мозга идеальной является краска с pH 7,4–7,5.

В качестве унифицированных приняты методики окраски по Нохту и Паппенгейму.

Реактивы для фиксации: 1) метиловый спирт или 2) раствор эозин-метиленового синего по Маю-Грюнвальду.

Реактивы для окраски мазков по Нохту: 1) основной раствор азура И: 1 г краски растворяют в 1 л дистиллированной воды, оставляют в посуде из темного стекла на 12-14 дней при комнатной температуре, после чего используют; 2) основной раствор эозина калия: 1 г краски растворяют в 1 л дистиллированной воды, оставляют в посуде из темного стекла на 12-14 дней при комнатной температуре, после чего используют; 3) фосфатный буфер (смесь Вейзе), pH 7,4-7,5: смешивают 0,49 г дигидрофосфата калия (KH2PO4) и 0,909 г гидрофосфата натрия (Na2HPO4) и растворяют в 1 л дистиллированной воды; 4) рабочий раствор азур-эозина: перед употреблением смешивают 25 мл основного раствора азура II, 20 мл основного раствора эозина калия и 55 мл буферного раствора (пропорции красителей могут варьировать, их устанавливают опытным путем при приготовлении свежих партий основных растворов).

Реактивы для окраски мазков по Паппенгейму: 1) раствор эозин-метиленового синего по Маю-Грюнвальду. При отсутствии готового раствора красителя его готовят растворением 1 г сухой краски в 1 л метилового спирта; 2) рабочий раствор азур-эозина по Нохту.

Фиксация мазков. Фиксирующий раствор наливают в кювету либо в широкогорлую посуду с притертой пробкой. Мазки помещают в контейнер, который погружают в кювету или кладут по одному в посуду на 5–10 мин. Контейнер со стеклами вынимают из фиксирующего раствора (или вынимают пинцетом стекла и устанавливают их в штативе) и оставляют на воздухе до полного высыхания.

Окраска по Нохту. Высохшие фиксированные мазки, не вынимая из контейнера, помещают в кювету с рабочим раствором краски на строго определенное время (20–45 мин), которое подбирают опытным путем для каждой партии краски. При отсутствии кюветы с контейнером стекла помещают горизонтально на параллельно положенные две стеклянные палочки («рельсы») мазком кверху и наливают на них по 3–4 мл рабочего раствора краски. Вынимают контейнер со стеклами из кюветы с красителем и помещают в кювету с водопроводной водой (при отсутствии контейнеров краску со стекол смывают водой, не снимая их со стеклянных палочек). Мазки высушивают на воздухе.

Окраска по Паппенгейму. Сухие нефиксированные мазки крови помещают в контейнер и опускают в кювету с раствором Мая-Грюнвальда на 3-5 мин (или на нефиксированный мазок наливают пипеткой 3-4 мл красителя). Контейнер с мазками ополаскивают в кювете с дистиллированной водой, а затем помещают в кювету с азур-эозиновой краской по Нохту на 8–15 мин. На стекла, помещенные на «рельсы», не сливая краситель, добавляют на 1 мин дистиллированную воду, а затем на 8–15 мин наливают на мазок краску, затем краску смывают водой. Мазки высушивают на воздухе.

Окраска по Романовскому-Гимзе. Производится так же, как по Нохту. В качестве красителя используют готовый раствор Романовского-Гимзы, который перед употреблением разводят из расчета 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды. Время окраски устанавливают опытным путем для каждой партии красителя (25–40 мин).

Окраска по Райту. Реактивы. 0,2 г краски Райта (сухой порошок, BDH/E. Merck) растворяют в 100 мл метилового спирта и дают постоять несколько дней. Если эритроциты окрашиваются недостаточно четко, готовят 0,25% или 0,3% раствор.

Ход окраски. На мазок наносят несколько (примерно 8) капель краски, выдерживают 2–3 мин (следят, чтобы краска не высохла), затем наливают на мазок равное количество забуференной воды. Если краска созрела, на поверхности разведенной краски появится пена или пленка с металлическим блеском. Разведенную краску оставляют на мазке на 2-3 мин, а затем смывают буферным раствором или водой. Нельзя допускать, чтобы краска осаждалась на поверхности мазка. Если это произошло, мазок заливают неразведенной краской на 15–20 с и затем еще раз буферным раствором или водой.

Приготовление фосфатного буфера.

Раствор А (0,2 М КН2PO4): 27,2 г соли растворить в 1 л дистиллированной воды.

Раствор Б (0,2 М Na2HPO4): 35,6 г Na2HPO4 × 2Н20 растворить в 1 л дистиллированной воды.

Для получения 100 мл буферного раствора с нужным pH следует слить растворы А и Б в количествах, указанных в таблице. Величину pH проверяют с помощью рН-метра.

Приготовление фосфатного буферного раствора

Раствор, мл	Величина pH

Окраска по Лейшману . Реактивы. 0,15 г сухой краски Лейшмана растворяют в 133 мл абсолютного метилового спирта. Краска должна полностью раствориться, желательно предварительно кристаллы краски растереть в ступке. Хранят краску в бутыли со стеклянной пробкой, не фильтруют.

Ход окраски. Осуществляют подобно окраске по Райту, но с двойным разведением буферного раствора. Несколько капель краски (около 8) наливают на мазок, выдерживают 2 мин. Добавляют двойное количество буферного раствора (16 капель), размешивают покачиванием и оставляют на 7–10 мин. Краску смывают дистиллированной водой за 2–3 секунды. При более длительном смывании окраска ухудшается. Мазки высушивают в штативе на воздухе.

Приготовление толстой капли крови . Три капли крови, нанесенные на предметное стекло на некотором расстоянии друг от друга, расширяют углом чистого предметного стекла до размера в диаметре примерно 1 см, маркируют карандашом, затем подсушивают на воздухе в течение 1–2 ч.

Окраска толстой капли крови . Толстые капли крови не фиксируют. Предметные стекла с хорошо просушенными толстыми каплями располагают на «рельсах» на некотором расстоянии друг от друга и на 8–10 мин наливают на них рабочий раствор азур-эозина по Нохту. Происходит «выщелачивание» эритроцитов. Затем краску сливают и на препараты наливают новую порцию рабочего раствора азур-эозина по Нохту на 30–35 мин. После этого предметные стекла осторожно ополаскивают дистиллированной водой и высушивают.

Автоматическая окраска мазков

Поскольку одной из наиболее востребованных функций в гематологической лаборатории являются приготовление и окраска мазков крови, естественны попытки их автоматизации.

Первая автоматическая система подготовки мазков была разработана компанией Sysmex (Япония) еще в 1990 г., и в настоящее время по всему миру установлено более 1600 систем. Огромный опыт, накопленный за этот период, был использован при разработке системы нового поколения - полностью автоматизированной станции подготовки и окраски мазков SP-1000i производительностью до 120 мазков в час. В SP-1000i реализуется высокая степень стандартизации и качества приготовления мазков благодаря использованию интеллектуального клинового метода, который дает возможность пользователю в зависимости от гематокрита исследуемой пробы регулировать объем наносимого образца крови, величину угла размазывающего лезвия, скорость нанесения и время ожидания, используя при этом от 8 до 16 различных уровней регулирования. Забор крови может осуществляться вручную или автоматически из открытых или закрытых пробирок. Автоматизированная станция подготовки и окраски мазков SP-1000i компании Sysmex (Япония)

В системе используется до семи гибко настраиваемых протоколов окраски, которые позволяют стандартизировать качество окраски мазков и удовлетворить самые высокие требования. Могут быть использованы следующие протоколы двойной и одиночной окраски: по Май-Грюнвальду-Гимзе, по Романовскому и по Романовскому-Гимзе. Мазки крови окрашиваются в выделенной кассетной системе, которая содержит только один слайд на кассету. При таком способе гарантируется хорошая взаимосвязь мазка крови с окрашивающими реагентами и при этом не происходит испарения метанола из реагента в воздух. Для гарантии хорошей фиксации крови перед окраской в процесс окраски интегрирован отдельный шаг по предварительной фиксации метанола.

Благодаря гибкости протокола окраски можно использовать специальный протокол для окраски костного мозга.

Методика приготовления мазков костного мозга для гематологических исследований.

Исследование костного мозга - миелограмма Первым вопросом, на который должно ответить исследование костного мозга является количественный аспект клеток. Хорошо известно, что в отношении периферической крови можно определить ряд цифровых значений количества и процента разных видов клеток, поскольку они находятся в свободном состоянии и относительно однородно распространены во взвеси сосудистой крови. Совершенно иное можно сказать о костном мозге: состав кроветворной ткани весьма разнородный и распределение костномозговых клеток неодинаково. Так, прямое счисление миелокариоцитов в камере колеблется в очень широких пределах, как при нормальном состоянии, так и в рамках той же болезни. Выявленные нами значения у лиц в норме колебались от 27 000 до 112 000 ядерных элементов на мм3 (Урся). Литературные данные колеблятся в еще более широких пределах, их лимиты составляют 12 000 и 300 000 на мм3 (Cartwright, Page). После центрифугирования в трубке гематокрита обнаруживаются следующие 4 слоя: 1) верхний жирный желтый слой; 2) плазма; 3) серо-белесый слой, образованный из ядерных клеток; 4) красный слой, составленный из эритроцитов. Измерение серо-белесового слоя из ядерных клеток (миелокрит) представляет ограниченное значение или даже вводит в заблуждение, поскольку выявленные значения у лиц в норме также дают значительные колебания. К тому же ядерные клетки обнаруживаются не только в этом слое, но также в жировом и эритроцитном слоях. Но из серобелесового слоя можно приготовить мазки костномозгового концентрата после устранения надосадочной плазмы. Они доказали свою пользу в процессе диагностирования в тех случаях, когда прямые мазки бедны клетками. Учитывая, что счисление в камере миелокариоцитов и определение миелокрита дают лишь приблизительные результаты с ограниченным воспроизведением, эти методы количественного определения не удовлетворительны. Извлекаемый при отсасывающей пункции материал составляет образец костного мозга, смешанного с кровью в различной пропорции. Степень разбавления костного мозга кровью зависит от ряда факторов. Мечение 32Р доказало, что разбавление отсасываемого костного мозга кровью колеблется от 40% до 100%. Впрочем следует отметить, что исследование костного мозга в целях постановки диагноза основывается, в первую очередь, на качественное исследование клеточного содержимого, а лишь второстепенно на количественные значения этого содержимого. Вот почему количественные методы определения костномозговых клеток состоят из полуколичеставенной оценки клеточного состава костного мозга, по сравнению с нормальными пробами, на: а) мазках с размозженными комочками; б) гистологических срезах. Исследование мазка проводится, в основном, сухим объективом, на нескольких мазках, при этом намечаются следующие цели: а) полуколичественная оценка костномозговой клеточной массы; б) определение наличия и плотности мегакариоцитов; в) выявление гигантских клеток или гнезд ненормальных клеток; г) отождествление наиболее подходящих участков для проведения исследования путем погружения. На мазках, полученных путем размозжения частиц костного мозга различаются следующие три концентрические зоны: а) центральная; б) внешняя; в) промежуточная. Центральную зону образуют жировые вакуоли, клетки стромы, гранулоциты и многочисленные разрушенные клетки. Внешняя зона содержит большое количество крови, которая разжижает костномозговые клетки. Подобно тонким мазкам она способствует лишь исследованию морфологических подробностей миелоидных клеток и эритроцитов. В промежуточной зоне находится наиболее плотная клеточная масса, что допускает оптимальное исследование, которое может выяснить все намечаемые вопросы. Здесь костномозговые клетки хорошо сохранены и расположены островками или гнездами, именно так, как наблюдается в костном мозге. Сохраняя костномозговую топографию получаемые результаты исследования этой зоны однороднее и соответствуют фактическому состоянию костного мозга, что подтверждается сопоставлением с его гистологическими изображениями. Полуколичественное определение клеточной плотности выражается в виде: а) нормального, б) богатого или в) скудного по сравнению с нормой костного мозга. Выявление нормальной или обильной клеточной массы представляет ценный результат, в то время как скудный костный мозг следует рассматривать с предосторожностью. Чтобы доказать наличие фактической гипоплазии следует рассмотреть несколько пластинок, сделать пункцию в нескольких костных территориях и/или биопсию костей. Наиболее точные сведения о костномозговой клеточной массе получаются исследованием гистологических срезов. У взрослого человека в норме отношение пространства, занимаемого жиром и активной клеточной паренхимой составляет 1: 1 или 2:1. Некоторыми авторами костный мозг рассматривается гипоклеточным когда кроветворные клетки занимают менее четверти костномозговых комочков. Качественное исследование костного мозга существенно для постановки диагноза. Оно проводится, с помощью погружения, как на тонких мазках, так и, в частности, на мазках с размозженными комочками из промежуточной зоны. Рекомендуется отбор наилучших правильно растянутых и окрашенных мазков с четко выделяющимися и морфологически хорошо законсервированными клетками. Это исследование намечает: а) выявление различных видов миелоидных клеток; б) определение степени созревания каждого клеточного ряда; в) уточнение отношения между гранулоцитами и эритробластами(Г/Э);: г) отождествление клеток на фазе митоза; д) описание встречающихся атипических клеток. После исследования нескольких мазков составляется либо подробная описательная «миелограмма» (содержащая сделанные, после расшифровки мазков, заключения), либо миелограмма в процентном отношении, установленная по не менее 300-500 элементам. Существуют два способа составления процентной миелограммы: 1) отнесение остальных клеточных рядов к 100 гранулоцитам; 2) процентное отображение каждого вида клеток из всего количества костномозговых клеток. Со статистической точки зрения последний способ представляется более правильным и видимо отражает реальную картину клеточного состава костного мозга. Установленные отдельными авторами формулы значительно разнятся, поскольку трудно определить реальныесредние величины в столь разнородном ткани, как костный мозг. В таблице приведены, по Wintrobe, результаты исследованияотобранных костномозговых проб от 12 лиц в норме. Нормальная миелограмма

Показатели миелограммы Среднее значение (%) Пределы колебаний (%)

Ретикулярные клетки 0,9 0,1-1,6 Недифференцированные бласты 0,6 0,1-1,1 Миелобласты 1,0 0,2-1,7

Промиелоциты 2,5 1,0-4,1

Миелоциты нейтрофильные 9,6 7,0-12,2 Метамиелоцитынейтрофильные 11,5 8,0-15,0 Палочкоядерные нейтрофилы 18,2 12,8-23,7 Сегментоядерные нейтрофилы 18,6 13,1-24,1 Всего клеток нейтрофильного ряда 60,8 52,7-68,9 Миелоциты эозинофильные 0,1 0,0-0,2 Метамиелоциты эозинофильные 0,2 0,1-0,4 Эозинофилы 2,8 0,4-5,2

Всего клеток эозинофилъного ряда 3,2 0,5-5,8 Миелоциты базофильные 0,1 0-0,3

Базофилы 0,1 0-0,3

Всего клеток базофильного ряда 0,2 0-0,5 Лимфобласты 0,1 0-0,2

Пролимфоциты 0,1 0-0,2

Лимфоциты 8,8 4,3-13,3

Всего клеток лимфоидного ряда 9,0 4,3-13,7 Монобласты 0,1 0-0,2

Моноциты 1,9 0,7-3,1

Плазмобласты 0,1 0-0,2

Проплазмоциты 0,1 0,1-0,2

Плазматические клетки 0,9 0,1-1,8

Эритробласты 0,6 0,2-1,1

Нормобласты базофильные 3,6 1,4-5,8 Нормобласты полихроматофильные 12,9 8,9-16,9 Нормобласты оксифильные 3,2 0,8-5,6

Всего клеток эритроидного ряда 20,5 14,5-26,5 Мегакариоциты 0,4 0,2-0,6

По нашим исследованиям на здоровых людях результаты следующие:

ряд гранулоцитов 56-70%,

эритробластический ряд 23-30%, лимфоплазмоцитный ряд 5-10%, моноцитомакрофаговый ряд 1-2% и мегакариоцитный ряд 0,1-0,8% (Урся). Изменение пропорции нормальных миелоидных рядов или их замена аномальными клетками нередко подсказывает вид болезни. Ретикулярные клетки появляются реже и притом в небольшом количестве. Совершенно случайно на мазках (или на отпечатках костного мозга) попадаются остеобласты и/или остеокласты, которые не следует принимать за неопластические клетки. Их наличие чаще отмечается у детей, реже у взрослых при первичном миелофиброзе или вторично, после карциноматозного метастаза, при острой лейкемии, остеопорозе и пр. Отношение Г/Э получается делением гранулоцитов на число эритробластов. У взрослого в норме это отношение составляет в среднем 3/1 или 4/1, при этом пределы оцениваются в 2/1 (когда включены лишь незрелые гранулоциты) и 5/1 (когда касается всех гранулоцитов - зрелых и незрелых). Отношение Г/Э колеблется с возрастом: при рождении невелик (1,8/1), в 2-недельном возрасте повышается до 11/1, затем постепенно понижается, а у годовалых детей достигает значений взрослого человека. Отношение Г/Э нормальное в случаях глобальной костномозговой гипо- или гиперплазии, равно как и при пролиферации отдельных клеток, не входящих в расчет этого отношения, например при плазмоцитоме. При лейкемиях, лейкомеподобных реакциях и эритробластопениях отношение высокое, в то время как при анемиях с эритробластической гиперплазией оно низкое или обратное (мегалобластическая, гемолитическая анемии). До выдачи данных миелограммы, полученных после исследования мазков, необходимо уточнить: а) место пункции; б) плотность кости; в) условия, в которых протекало отсасывание; г) макроскопический аспект отобранного материала. Исследование костного мозга комплексный процесс, основывающийся на интеграцию многочисленных и разнообразных данных. Его результат должен отражать выводы общего характера, основывающиеся больше на умозаключение, чем на механическую регистрацию отдельных цифр, которые, к тому же, колеблятся. Заключение любой миелограммы должно уточнить либо диагноз, либо указания для дополнительных исследований, вытекающих из исследования костного мозга. При заболеваниях крови отсасывающая пункция способствует уточнению диагноза с помощью мазков и срезов с комочками в 80% случаях. В остальных случаях показана костная биопсия и гистологическое исследование костного мозга. Биоптический отбор и гистологическое исследование представляются необходимыми при: а) первичном или вторичном миелофиброзе; б) костномозговой аплазии или гипоплазии; в) заболеваниях, протекающих с поражениями грануломатозного типа (напр., болезнь Годжкина, саркоидоз, туберкулез и пр.); г) карциноматозном метастазе; д) во всех случаях, когда отобранный с помощью пункции материал оказывается неудовлетворительным или аспект костного мозга не убедительный. После биоптического отбора пробы приготовляются отиски для проведения цитологического исследования, поскольку гистологические срезы предоставляют мало сведений о структурных подробностях кроветворных клеток, находящихся в скученном, не рассеянном и неэталированном виде. К тому же закрепление вызывает ретракцию клеток и гистологическая окраска менее селективна, чем цитологическая. Вот почему полное исследование костного мозга предполагает, как цитологическое - на мазках или оттисках, так и гистологическое - на срезах исследования. Необходимо помнить, что цитологические и гистологические методы исследования костного мозга не исключаются а, наоборот, взаимодополняются: биопсия - количественный и архитектурный метод, в то время как миелограмма - качественный и цитологический.

Методика подсчета форменных элементов крови в камере Горяева.

Камера Горяева - приспособление, предназначенное для подсчета количества клеток в заданном объёме жидкости. Обычно ее используют для определения числа форменных элементов в образце крови. Камеры состоят из толстого предметного стекла с нанесенными на них поперечными прорезями, образующими три поперечно расположенные плоские площадки. Средняя площадка продольной прорезью разделена на две, каждая из которых имеет выгравированную на ней сетку. По обе стороны средней площадки в камере Горяева расположены две других на 0,1 мм (в камере Фукс-Розенталя на 0,2 мм) выше средней. Плоскости этих площадок служат для притирания покровного стекла до появления так называемых Ньютоновских колец. После притирания покровного стекла создается камера, закрытая с двух боковых сторон, а с двух других остаются щели (капиллярные пространства), через которые и заполняют камеру. Принцип сеток один и тот же. Они разделены на то или иное число квадратов, различным образом сгруппированных. Постоянной величиной во всех сетках является так называемый «малый квадрат», сторона которого равна 1/20 мм, следовательно, его площадь равна 1/400 мм2. При помощи камеры Горяева возможно также определить увеличение микроскопа. Внешне представляет собой прозрачный параллелепипед (предметное стекло), с бороздами и нанесённой микроскопической сеткой. Размеры малых делений клетки сетки составляют 0,05 мм, а больших - 0,2 мм. При этом сетка нанесена на площадку (участок стекла), расположенный на 0,1 мм ниже, чем две соседние площадки. Эти площадки служат для притирания покровного стекла. В результате объем жидкости над квадратом, образованным большими делениями сетки Горяева, составляет 0,004 микролитра. Подсчитав количество клеток над большим квадратом можно подсчитать плотность данного типа клеток в суспензии по формуле: Количество клеток/мл = количество клеток над большим квадратом * 2,5 10^5 Используя камеру Горяева как своеобразный эталон можно определить увеличение микроскопа по формуле: Kg=(m2-m1)/(a*N) где kG - это увеличение микроскопа; m 1 - положение левой границы клетки камеры Горяева; m 2 - положение правой границы клетки или группы клеток; N - количество клеток между измеряемыми границами; a - размер клетки камеры Горяева (равен 0,05 мм). Камера Горяева также используется для подсчёта количества клеток в культуре. Формула для подсчета кровяных телец в камере Горяева - x = (а · 400 · в) / б, где x - искомое количество форменных элементов в 1 мм3; а - сумма форменных элементов, сосчитанных в определенном объеме камеры; б - количество сосчитанных малых квадратов; в - разведение крови.

Метод подсчета ооцист в камере Горяева. Этим методом обычно пользуются при экспериментальном заражении животных точно установленным количеством ооцист (животному вводится соответствующее количество миллилитров взвеси). 1 мл взвеси, содержащей ооцисты, помещают в камеру Горяева. Поскольку объем камеры Горяева составляет 0,9 м3, количество подсчитанных ооцист умножается на 1111. Полученное число адекватно количеству ооцист в 1 см 3 раствора. Для более точного определения расчеты следует проводить не менее трех раз, а затем вывести среднюю арифметическую величину. Нужное для заражения количество ооцист отмеряют с помощью градуированной пипетки. Для более равномерного распределения ооцист в инкубационной среде содержимое пробирки необходимо неоднократно встряхнуть.

Подсчет эритроцитов в камере Горяева Принцип. Точное количество крови равномерно смешивают в определенном количестве жидкости и помещают в камеру с известным объемом в котором взвесь крови распределяется одним слоем. Дно камеры разграфлено, благодаря чему возможен точный подсчет эритроцитов. Реактивы: 0,9%-ный раствор натрия хлорида. Специальное оборудование: микроскоп, камера Горяева, пробирки лабораторные или капилляр от гемометра Сали. Ход определения. В сухую чистую пробирку вносят 8 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида и капиллярной пипеткой 0, 02 мл крови. Предварительно кончик пипетки вытирают, кровь выдувают на дно пробирки, а пипетку тщательно промывают верхним слоем жидкости. Содержимое пробирки хорошо перемешивают. Получают разведение крови 1: 400, т. е. кровь разбавляют в 400 раз. При сгущении крови ее целесообразно разбавить в 500, 600, 700, 800 раз. Камера и покровное стекло должно быть вымыты и насухо вытерты. Покровное стекло притирают к камере так, чтобы появились радужные кольца. Берут каплю разведенной крови из пробирки и заполняют ею камеру, нанося к краю покровного стекла Эритроциты подсчитывают через 1 мин после заполнения камеры под малым увеличением микроскопа (объектив х8, окуляр х10 или х 15) с прикрытой диафрагмой или опущенным конденсатором (в затемненном поле зрения). Эритроциты подсчитывают в пяти больших (или 80 малых) квадратах, расположенных по диагонали. Учитывают эритроциты, лежащие внутри малого квадрата, а также на левой и верхней его стенках. Клетки, находящиеся на правой и нижней линиях квадрата, не считают. Расчет: Подсчитанное число клеток в 80 малых квадратах умножают на 20 000 при разведении крови 1: 400, на 25 000 при разведении 1: 500 или на 30 000 при разведении 1: 600 и получают окончательный результат в миллионах в 1 мкл. При этом исходят из того, что объем одного малого квадрата равен 1/4000 мкл. Для подсчета клеток в 1 л количество эритроцитов в 1 мкл еще умножают на 1 000 000. Примечание. Не допускается исследование крови со сгустками; подсчет клеток тотчас после заполнения камеры (не выжидая 1 мин); использование плохо вымытых и просушенных пипеток и пробирок, недоброкачественных реактивов, вызывающих гемолиз. При соблюдении всех правил подсчета ошибка составит в среднем ±2,5 %.

Правила дезинфекции После использования камеру Горяева необходимо продезинфицировать 3% раствором перекиси водорода, промыть дистиллированной водой и вытереть мягкой салфеткой. Хранить камеру следует в сухом месте.

Методика работы на гематологических анализаторах.

Анализа́торгематологи́ческий - прибор (комплекс оборудования), предназначенный для проведения количественных исследований клеток крови в клинико-диагностических лабораториях. Может быть автоматическим или полуавтоматическим. Полуавтоматический гематологический анализатор от автоматического отличается тем, что процесс разведения пробы крови осуществляется отдельным прибором - дилютером. После приготовления разведения цельной крови оператор должен перенести разведенную пробу в модуль измерения. В настоящее время полуавтоматические анализаторы практически не выпускаются.

Автоматический гематологический анализатор представляет собой полностью автоматизированный прибор, в котором весь аналитический процесс выполняется автоматически.

Современные автоматические анализаторы способны обрабатывать десятки образцов (от 60 до 120) в час, с соответствующей спецификации точностью и воспроизводимостью, а также хранить результаты тестов во встроенной памяти и, при необходимости, распечатывать их на встроенном термопринтере или внешнем принтере.

Современные гематологические анализаторы классифицируются по номенклатуре определяемых показателей клеток крови.

Восьми-параметровые гематологические анализаторы определяют следующие параметры: концентрации эритроцитов (RBC), лейкоцитов (WBC), тромбоцитов (Plt), гемоглобина (Hb), а также следующие параметры эритроцитов: средний объем эритроцитов (MCV), среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (MCH), среднюю концентрацию гемоглобина в эритроцитах (MCHC), гематокрит (Hct).

Восьми параметровые гематологические анализаторы в настоящее время практически не производятся.

Гематологические анализаторы класса 3-диф . Гематологические анализаторы класса 3-диф, в зависимости от выпускаемой модели, позволяют определять от 16 до 22 показателей клеток крови. Анализаторы этого класса, помимо тех параметров, которые определяют восьми-параметровые анализаторы определяют три субпопуляции лейкоцитов: концентрации лимфоцитов (Lm), гранулоцитов (Gr) и, так называемых средних лейкоцитов (Mid), а также их процентное содержание Lm%, Gr% и Mid%. Отсюда и название класса 3-диф. Кроме этого гематологические анализаторы этого класса определяют коэффициент вариации объема эритроцитов (RDW) и ряд показателей, характеризующих тромбоциты: средний объем тромбоцитов (MPV), долю объема тромбоцитов(Tct) (аналог гематокрита), коэффициент вариации объема тромбоцитов (PDW).

Важной диагностической информацией, которую позволяет получить гематологические анализаторы этого класса, являются функции распределения по объему эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов - гистограммы.

Гематологические анализаторы класса 5-диф. Основным отличаем гематологических анализаторов 5-диф от анализаторов 3-диф является их способность определять все 5 субпопуляций лейкоцитов: лимфоциты (Lym), моноциты (Mon), нейтрофилы (Neu), базофилы (Bas) и эозинофилы (Eos), а также их процентное содержание Lym%, Mon%, Neu%, Bas% и Eos%. Импедансный метод подсчета, известный также как счетчик Коултера , применяемый в анализаторах 3-диф, не в состоянии различить нейтрофилы, базофилы и эозинофилы, по этому в анализаторах 5-диф применяется иной метод дифференцировки клеток. Он основан на принципе дифракции лазерного излучения на клетках лейкоцитов и дальнейшем анализе рассеянного излучения. "Средние" лейкоциты не отличаются по размеру настолько что бы различать их импедансным методом, но имеют различную внутреннюю структуру и по разному взаимодействуют с красителями. А метод детектирования дифракционной картины оказывается чувствительным ко внутренней структуре клеток. Таким образом эритроциты и тромбоциты подсчитываются счетчиком Коултера, а лейкоциты отдельным лазерным блоком.

Работа 8. Количественное определение белка в сыворотке крови

4. Состав и свойства сложных белков

Работа 9. Химическая природа гемпротеидов

Работа 10. Выявление углеводного компонента гликопротеидов

Работа 11. Качественные реакции на фосфопротеиды

Работа 12. Количественное определение содержания сиаловых кислот в сыворотке крови методом Гесса

Работа 13. Химическая природа нуклеопротеидов

Нуклеиновые кислоты

1. Исследование химической природы нуклеиновых кислот

Работа 14. Качественные реакции на компоненты нуклеиновых кислот

Количественные методы определения нуклеиновых кислот

Работа 15. Спектрофотометрический метод количественного определения нуклеиновых кислот по а.С.Спирину

Работа 16. Фотоколориметрические методы количественного определения нуклеиновых кислот

Работа 17. Исследование фосфолипидов

Работа 18. Качественные реакции на стероиды

Ферменты

Сравнительное действие ферментов и небиологических катализаторов

Работа 19. Сравнение действия α-амилазы слюны и соляной кислоты на реакцию гидролиза крахмала

2. Выявление ферментов, относящихся к разным классам

Работа 20. Обнаружение оксидоредуктаз в биологическом материале

Работа 21. Обнаружение холинэстеразы

В сыворотке крови экспресс-методом Херцфельда и Штумпфа

Работа 22. Определение активности фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы в сыворотке крови по методу в.И.Товарницкого и е.Н.Волуйской

Построение калибровочного графика

Работа 23. Определение глюкозофосфат-изомеразы

В сыворотке крови

3. Изучение кинетических свойств ферментов

Работа 24. Кинетика ферментативных реакций на примере α-амилазы слюны

4. Специфичность действия ферментов

Работа 25. Демонстрация абсолютной субстратной специфичности

5. Модификаторы активности ферментов

Работа 27. Активаторы и ингибиторы α-амилазы слюны

Мышечной ткани

Работа 29. Неконкурентное ингибирование каталазы крови

6. Количественное определение активности ферментов

Работа 30. Количественное исследование активности препарата лактатдегидрогеназы по Корнбергу

Работа 31. Фотоколориметрический метод исследования активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по Севелу и Товареку

Работа 32. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по Боданскому

7. Исследование изоферментов

Работа 33. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы сыворотки крови методом электрофореза в полиакриламидном геле по Дитцу и Лубрано

Работа 34. Определение активности γ-глутамилтрансферазы в сыворотке крови

Биохимия пищеварения

Работа 35. Исследование кислотных компонентов желудочного сока

Работа 36. Определение кислотности желудочного сока диагностическим набором «Ацидотест»

Работа 37. Гидролиз белка ферментами пищеварительного тракта

Работа 38. Изучение динамики гидролиза триацилглицеринов под действием панкреатической липазы

Энергетический обмен (биоэнергетика)

1. Исследование процессов биологического окисления в животных тканях Работа 39. Обнаружение цитохромоксидазы в мышечной ткани

Работа 40. Демонстрация процесса окислительного фосфорилирования и действия на него разобщителей

Работа 41. Выявление гликолиза в мышечной ткани

Работа 42. Анализ адениннуклеотидов методом ионообменной тонкослойной хроматографии

Работа 43. Определение активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови по Эннору и Розенбергу

Анализ пигментов и окислительных процессов фотосинтезирующих организмов

Работа 44. Качественные реакции на пигменты растений

Работа 45. Определение активности пероксидазы в растительном материале по методу а.Н.Бояркина

Обмен углеводов

Работа 46. Определение содержания глюкозы в крови

Работа 47. Количественное определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом

Работа 48. Определение содержания молочной кислоты в крови по Баркеру и Саммерсону

Работа 49. Определение содержания пировиноградной кислоты в крови по Фридеману и Хаугену

Обмен липидов

Работа 50. Определение содержания суммарных липидов в сыворотке крови по реакции с сульфофосфованилиновым реактивом

Работа 51. Определение содержания β- и пре- β-липопротеидов сыворотки крови турбидиметрическим методом по Бурштейну и Самай

Работа 52. Определение содержания холестерина в сыворотке крови по методу Илька

Работа 53. Определение содержания общих фосфолипидов в сыворотке крови

Работа 54. Разделение липидов сыворотки крови методом тонкослойной хроматографии

Обмен белков и аминокислот

Работа 55. Определение содержания белковых фракций сыворотки крови турбидиметрическим методом

Работа 56. Определение активности катепсинов в сыворотке крови по а.А.Покровскому, а.И.Арчакову и о.Н.Любимцевой

Катепсины

Работа 57. Определение активности аспартат- и аланин­- аминотрансферазы в сыворотке крови по Райтману и Френкелю

Работа 58. Определение активности гистидазы в сыворотке крови по Табору и Мелеру в модификации в.А.Буробина

Работа 59. Определение содержания свободного гидроксипролина в моче по Нейману и Логану в модификации п.Н.Шараева

Обмен азотсодержащих небелковых веществ

1. Исследование общих продуктов азотистого обмена

Работа 60. Количественное определение остаточного азота в крови фотоколориметрическим методом

Работа 61. Количественное определение мочевины в сыворотке крови и моче

Работа 62. Количественное определение креатина и креатинина по методу Брауна

2. Изучение обмена нуклеиновых кислот и нуклеотидов

Работа 63. Определение активности кислой дезоксирибонуклеазы (днКазы) в сыворотке крови по а.А.Покровскому, а.И.Арчакову и о.Н.Любимцевой

Работа 64. Определение содержания мочевой кислоты в сыворотке крови по методу Мюллера и Зейферта

3. Исследование порфиринового (пигментного) обмена

Работа 65. Определение билирубина и его фракций в сыворотке крови по Йендрашику, Клеггорну и Грофу

Молекулярная патология

1. Экспресс-диагностика патологии аминокислотного обмена Работа 66. Выявление гипераминоацидурии

Работа 67. Экспресс-методы диагностики фенилкетонурии

Работа 68. Диагностика тирозиноза пробой Миллона на тирозин

Работа 69. Выявление алкаптонурии пробой на гомогентизиновую кислоту

Работа 70. Выявление цистинурии иод-азидной пробой на цистин и гомоцистин в моче

2. Экспресс-диагностика патологий углеводного обмена Работа 71. Выявление пентозурии пробой Биаля

Работа 72. Выявление фруктозурии пробой Селиванова

Работа 73. Выявление мукополисахаридозов пробой с толуидиновым синим на мукополисахариды

Работа 74. Определение содержания порфобилиногена в моче

Работа 75. Количественное определение содержания дельта-аминолевулиновой кислоты в моче

Работа 76. Количественное определение содержания копропорфирина в моче по методу Соулсби в модификации Римингтона

Регуляторы обмена веществ

1. Исследование витаминов Работа 77. Качественные реакции на витамины

Работа 78. Определение содержания тиамина и рибофлавина флуориметрическим методом в поливитаминных препаратах

Работа 79. Количественное определение аскорбиновой кислоты в лекарственных растениях

2. Исследования гормонов, медиаторов и их метаболитов

Работа 80. Качественные реакции на белково-пептидные гормоны.

Работа 81. Качественные реакции на гормоны – производные аминокислот

Работа 82. Качественные реакции на стероидные гормоны и их метаболиты

Работа 83. Регуляция инсулином и адреналином уровня глюкозы в крови животных

Работа 84. Количественное определение гистамина в крови с диазотированным n-нитроанилином по н.В.Климкиной и с.И.Плитману

Исследование биологических жидкостей

1. Биохимические исследования крови Работа 85. Определение содержания гемоглобина в крови по его светопоглощению

Работа 86. Определение содержания фетального гемоглобина в эритроцитах крови человека

Работа 87. Определение содержания гликозилированного гемоглобина в эритроцитах крови фотоколориметрическим методом

Работа 88. Определение концентрации гаптоглобинов в сыворотке крови фотоколориметрическим методом

Работа 89. Проба Вельтмана в модификации Тейфеля на коллоидную устойчивость белков сыворотки крови

Работа 90. Определение активности α-амилазы в сыворотке крови амилокластическим методом

Работа 91. Определение содержания кальция в сыворотке крови мурексидным методом

Работа 92. Тимоловая проба по Хуэрго и Поппер

Работа 93. Сулемово-осадочная реакция

Работа 94. Количественное определение содержания железа в сыворотке крови

2. Биохимическое исследование мочи

Работа 95. Исследование физико-химических свойств мочи

Работа 96. Определение кетоновых тел и глюкозы в моче

Работа 97. Определение белка в моче по методу Бранденберга-Робертса-Стольникова

Работа 98. Качественное определение индикана в моче

Работа 99. Обнаружение некоторых пигментов в моче.

Метаболизм ксенобиотиков

Исследование процессов окисления и конъюгации ксенобиотиков Работа 100. Выявление дыхательной активности микросом

Работа 101. Исследование окислительного n-деметилирования в микросомах печени по Нашу

Работа 102. Определение гидроксилазной активности микросом печени по Като и Жилете

Работа 103. Метод оценки активности монооксигеназ эндоплазматической сети клеток печени по выделению метаболитов амидопирина с мочой по т.А.Попову и о.Д.Леоненко

Работа 104. Определение активности алкогольдегидрогеназы в сыворотке крови по Шкурски и др. С дополнениями и.В.Бокия, м.С.Усатенко и в.Ф.Трюфанова

Работа 105. Определение ацетилирующей способности организма по выделению с мочой свободной и ацетилированной форм сульфаниламидов по а.М.Тимофеевой в модификации г.А.Пономарева

Работа 106. Выявление ацетилирования (инактивации) гидразида изоникотиновой кислоты (гинк) в организме

Исследование пероксидного окисления липидов биологических мемебран

Работа 107. Определение чувствительности эритроцитов к пероксидному гемолизу

Работа 108. Определение скорости пероксидного окисления липидов в биомембранах

Приложение

2.Биохимические показатели плазмы крови

1.Общие клинические нормы

2. Специальное исследование мочи

Желудочный сок

2. Фосфатный буфер (0,1 м, рН 5,8-8,0)

3. Трис-буфер (0,1 м, рН 7,1-9,2)

4. Ацетатный буфер (0,2 м, рН 3,6-5,8)

5. Глициновый буфер (0,05 м, рН 8,6-10,6)

3. Приготовление некоторых реактивов

Оглавление

2. Фосфатный буфер (0,1 м, рН 5,8-8,0)

Na 2 HPO 4 0,2 М, мл	Na 2 H 2 PO 4 0,2 М, мл

3. Трис-буфер (0,1 м, рН 7,1-9,2)

24,2 г трис-(гидроксиметил) аминометана растворяют в мерной колбе вместимостью 1 л (в 500 мл Н 2 О). Для получения необходимого значения рН прибавляют указанный в таблице объем 1 М HCl и доводят объем дистиллированной водой до 1000 мл.

4. Ацетатный буфер (0,2 м, рН 3,6-5,8)

Ацетат натрия 0,2 М, мл	Уксусная кислота 0,2 М, мл		Ацетат натрия 0,2 М, мл	Уксусная кислота 0,2 М, мл

5. Глициновый буфер (0,05 м, рН 8,6-10,6)

Смешивают указанные объемы глицина и гидроксида натрия и доводят объем дистиллированной водой до 200 мл

	Глицин 0,2 М, мл	NaOH 0,2 М, мл		Глицин 0,2 М, мл	NaOH 0,2 М, мл

3. Приготовление некоторых реактивов

Активирующий раствор . В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 155 мг восстановленного глутатиона и 400 мг кристаллического альбумина, растворяют их в 50 мл дистиллированной воды и с помощью 1 М раствора NaOH доводят рН до 8,2. Затем доливают до метки воду.

Аммиачный раствор нитрата серебра . К 2-3%-ному раствору серебра добавляют концентрированный раствор аммиака до растворения осадка.

Ацетатный буферный раствор рН 3,6 . Готовят смешивая 463 мл раствора А и 37 мл раствора Б, доводят до метки водой в мерной колбе до 1 л. Раствор А: 11,55 мл ледяной уксусной кислоты разводят водой в мерной колбе на 1 л. Раствор Б: 27,2 г ацетата натрия растворяют в воде в колбе на 1 л.

Биуретовый реактив (реактив Бенедикта) . 173 г цитрата натрия и 100 г карбоната натрия растворяют в 300 мл дистиллированной воды на водяной бане. Отдельно в 300 мл воды растворяют 17,3 г сульфата меди. Оба раствора сливают и доводят общий объем до 1 л.

Буферный раствор . 2,76 г веронала и 2,06 г мединала растворяют в 1 л дистиллированной воды. Хранят в холодильнике, при появлении осадка раствор не пригоден к употреблению.

Взвесь угля . 0,25 г активированного угля помещают в мерную колбу на 100 мл и разбавляют ацетатным буфером рН 3,6. Перед употреблением тщательно встряхивать.

Восстанавливающий реактив . 1%-ный раствор аскорбиновой кислоты, приготовленный на 0,016%-ном растворе сульфата меди.

Гемоглобин, 4%-ный раствор на ацетатном буфере (рН 4,0) . Сначала готовят 8%-ный раствор гемоглобина на 8 моль/л растворе мочевины, выдерживают его 2 ч в термостате при 60˚С и перед употреблением разводят ацетатным буфером в 2 раза.

Глицил-глицин . 0,55 ммоль/л, рН – 8,3. 3,63 г глицил-глицина помещают в мерную колбу на 50 мл, доливают водой до метки (буферный раствор).

Денатурирующий раствор

Диазореактив для определения билирубина . Готовят два раствора. Первый раствор: 3 г сульфаниловой кислоты растворяют в 500 мл дистиллированной воды, добавляют 15 мл концентрированной соляной кислоты (на горячей бане), доводят объем водой до 1 л. Второй раствор: 0,5%-ный водный раствор нитрита натрия. Перед употреблением смешивают 5 мл первого раствора и 0,25 мл второго.

Диацетил, рабочий раствор . 1 мл диацетила разводят дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл (раствор хранят в холодильнике). Рабочий раствор диацетила готовят перед употреблением, добавляя в 1 мл основного раствора диацетила 24 мл дистиллированной воды.

Дифениламиновый реактив . 1 г дифениламина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты. К раствору прибавляют 2,75 мл концентрированной серной кислоты.

Калибровочный раствор . Основной – 0,75 ммоль/л АЛК (100 мкг/мл) в пересчете на основание: 0,00635 г АЛК гидрохлорида растворяют в ацетатном буфере рН 3,6 в мерной колбе на 50 мл. Хранят в холодильнике не более месяца. Из основного готовится рабочий калибровочный раствор, 1 мкг/мл. Готовят перед употреблением разведением основного раствора ацетатным буфером в 100 раз.

Калибровочный раствор . 22,5 мг диоксиацетона при нагревании растворяют в 25 мл воды. 1 мл такого раствора содержит 10 мкмолей диоксиацетона. В ряд пробирок (см. работу) разливают калибровочный раствор диоксиацетона, доливают до нужного объема и далее проводят реакцию также, как и при определении активности фермента.

Калибровочный (стандартный) раствор железа (30 мкмоль/л) .

Сначала готовят соли Мора.

Кофеиновый реактив . 1 г чистого кофеина, 7,5 г бензоата натрия, 12,5 г ацетата натрия растворяют в 90 мл дистиллированной воды, нагревают до 50-60˚С, перемешивают, охлаждают и доводят до 100 мл дистиллированной водой.

Молибдат аммония в азотной кислоте . 7,5 г молибдата аммония растворяют в 100 мл воды и прибавляют 100 мл 32%-ной азотной кислоты.

Моча при алкаптонурии . При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют гидрохинон из расчета 20 г/л.

Моча при гипераминоацидурии . При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют глицин из расчета 1,0 г/л.

Моча при мукополисахаридозе . При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют хонсурид или гепарин из расчета 0,05-0,1 г/л.

Моча при пентозурии . При отсутствии патологической в мочу добавляют ксилулозу или рибозу из расчета 1,0 г/л.

Моча при тирозинозе . При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют тирозин из расчета 0,4-0,5 г/л.

Моча при фруктозурии . При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют фруктозу из расчета 0,3-0,4 г/л.

Моча при цистинурии . При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют цистин из расчета 0,4-0,5 г/л.

Натрия ацетат 3-водный, насыщенный раствор . 375 г ацетата натрия 3-водного (или 226 г безводной соли) растворяют в 250 мл теплой воды, охлаждают до комнатной температуры. Хранят при комнатной температуре. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным.

Натрий фосфат двузамещенный 0,25 моль/л. Готовят, растворяя 9,7 г Na 2 HPO 4 ∙12H 2 O или 18 г Na 2 HPO 4 ∙12H 2 O в воде в колбе на 200 мл. При добавлении 2 мл этого раствора к 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты рН должен быть в пределах 5,0-6,0.

Основной калибровочный раствор креатинина, 10 ммоль/л . 113,1 мг креатинина доводят до 100 мл 0,1 моль/л раствором соляной кислоты. При построении калибровочного графика из основного раствора готовят рабочий раствор путем разведения основного раствора водой в 100 раз, 1 мл раствора содержит 0,1 ммоль креатинина. Исходя из этого получают ряд пробирок с соответствующими концентрациями креатина.

Окислительная смесь для определения тиамина . К 8 мл 1%-ного гексацианоферрата (III) калия приливают 20 мл 30%-ного раствора NaOH, тщательно перемешивают. Готовят перед употреблением.

Орциновый реактив . К 1 г орцина прилить 500 мл 30%-ной соляной кислоты (плотностью 1,15 г/см 3). Перемешать до растворения и добавить 4-5 мл 10%-ного раствора хлорида железа (III) FeCl 3 . Реактив хранят в плотно закупоренной темной склянке.

Основной калибровочный раствор п-нитроанилина . 0,0829 г п-нитро­анилина помещают в мерную колбу на 100 мл, доводят до метки водой и растворяют.

Осаждающий раствор . Растворить 561 г сульфата аммония в 1 л дистиллированной воды и через сутки профильтровать.

Основной фосфатный буферный раствор и его рабочие растворы № 1-4 . Растворяют 33,5 г NaOH в 400 мл воды в мерной колбе вместимостью 500 мл и добавляют 226,8 г KH 2 PO 4 , встряхивают до полного растворения, охлаждают и доливают водой до метки. Для приготовления рабочих растворов основного фосфатного буфера в мерные колбы вместимостью 100 мл отмеривают следующие объемы основного фосфатного буфера (в мл): № 1 – 92,51; № 2 – 74,91; № 3 – 59,18 и № 4 – 48,68, после чего доводят их содержимое водой до метки.

Пикриновая кислота, насыщенный раствор . Товарная пикриновая кислота содержит 15-20% влажности, кислоту не сушить. Взрывоопасно! В 100 мл воды растворяют 2 г пикриновой кислоты при нагревании в горячей бане. После этого раствор оставляют стоять на 24 часа, периодически перемешивая. Затем раствор фильтруют. Раствор стабилен и хранится в посуде из темного стекла.

Пирофосфатный буфер 0,05 М с рН 8,2 . Переносят 4,46 г пирофосфата натрия в мерную колбу вместимостью 200 мл, растворяют его примерно в 100 мл воды, доводят рН с помощью 0,1 М раствора HCl до 8,2 и доливают дистиллированной водой до метки.

Пирофосфатный буфер 0,1 М с рН 8,5 . Переносят 4,46 г пирофосфата натрия в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют его в 50 мл воды, доводят рН с помощью 0,1 М раствора HCl до 8,5 и доливают дистиллированной водой до метки.

Рабочий реактив . Готовят в день определения, смешивая 30 частей 0,3 н гидроксида натрия. 2 части 0,5% раствора фенолфталеина и 1 часть 0,12% раствора сульфата меди.

Раствор ацетонциангидрина . Растворить 1 ампулу ацетонциангидрина (0,5 мл – 0,47 г из набора по определению гемоглобина в крови) в 1 л дистиллированной воды.

Раствор ферриацетонциангидрина . Растворить в 1 л дистиллированной воды 200 мг железосинеродистого калия и 1 ампулу (0,5 мл – 0,47 г) ацетонциангидрина: возможно использование из набора реактивов для приготовления трансформирующего раствора по определению гемоглобина крови. Устойчив в течение нескольких месяцев при хранении в посуде из темного стекла при комнатной температуре.

Раствор глюоксидазы . Содержит около 300 ед. в 1 мг. Готовят, растворяя соответствующее количество сухого препарата в 10 мл воды.

Раствор сульфонированного бато-фенантролина . В пробирке к 100 мг бато-фенантролина приливают 0,5 мл хлорсульфоновой кислоты, нагревают на кипящей водяной бане 30 с, охлаждают и медленно приливают 10 мл бидистиллированной воды, вновь нагревают на водяной бане в течение 5 мин. Смесь переносят в колбу на 200 мл, добавляют 100 мл воды, рН раствора доводят до 4-5 н NaOH и добавляют водой до объема 200 мл.

Раствор иода в иодиде калия (раствор Люголя) . В 100 мл дистиллированной воды растворяют 20 г иодида калия и 10 г иода. Перед употреблением раствор разводят в 5 раз.

Раствор п-нитрозодиметиланилина (НДМА) . Имеющийся в продаже препарат НДМА перекристаллизовывают из этилового эфира. Для измерения алкогольдегидрогеназы 1 мг НДМА растворяют в 100 мл 0,1 М пирофосфатного буфера (рН 8,5). Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр и разводят фильтрат в 2 раза тем буфером. Хранят при 4˚С в течение двух месяцев.

Реактив Илька . К 5 частям (по объему) уксусного ангидрида добавляют 1 часть ледяной уксусной кислоты, затем постепенно вливают 1 часть концентрированной серной кислоты. Хранить реактив на холоду!

Реактив Миллона . (Готовят под тягой! ) В 57 мл концентрированной азотной кислоты растворяют 40 г ртути сначала на холоду, а затем нагревая на водяной бане. Полученный раствор разбавляют 2 объемами воды, дают отстояться и сливают с осадка. Хранят во флаконе из темного стекла.

Реактив молибдата аммония . 2,5 г молибдата аммония растворяют в 60 мл дистиллированной воды, фильтруют. Раствор вносят в колбу вместимостью 100 мл. В другой колбе к 25 мл дистиллированной воды приливают 7,5 мл концентрированной серной кислоты. Второй раствор приливают к первому, охлаждают и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор пригоден в течение месяца.

Реактив «НАДИ» . 1%-ный раствор диметил-п-фенилендиамина смешивают с равным объемом 1%-ного раствора α-нафтола в спирте и 1,5%-ного раствора карбоната натрия. Раствор окрашен в темно-коричневый цвет и не должен иметь розового оттенка. Готовят за 1 ч до занятия.

Реактив Наша . В колбу вместимостью 100 мл вносят 15,4 г ацетата аммония, 0,3 г ледяной уксусной кислоты и 0,2 г ацетилацетона, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до метки.

Реактив Несслера . В мерной колбе вместимостью 500 мл смешивают 150 г иодида калия, 110 г иода, 100 мл дистиллированной воды и около 140-150 г металлической ртути и сильно встряхивают в течение 15 мин. При этом раствор самопроизвольно разогревается, и окраска, обусловленная растворенным иодом, постепенно бледнеет. Затем смесь начинают охлаждать под струей воды до сохранения отчетливой красной окраски, после чего содержимое встряхивают до перехода красной окраски в зеленоватую. После декантации осадок ртути тщательно промывают водой. Объединяют раствор и промывные воды, разбавляют их водой до 2 л. Отбирают 75 мл полученного раствора в мерную колбу вместимостью 0,5 л, содержащую 75 мл воды и 350 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия и доводят водой до метки.

Реактив Фелинга . Готовят отдельно два раствора. Раствор 1: в мерной колбе вместимостью 1 л растворяют 200 г сегнетовой соли и 150 г NaOH и доводят водой до метки. Раствор 2: в мерной колбе вместимостью 1 л растворяют в воде 40 г сульфата меди (II) и доводят водой до метки. Перед употреблением смешивают равные объемы этих растворов.

Реактив Фолина . В колбе вместимостью 1 л растворяют 1 г вольфрамата натрия и 20 г фосфорномолибденовой кислоты в 750 мл воды. Закрывают колбу пробкой с обратным холодильником и, включив ток воды в холодильнике, содержимое кипятят 10 ч; затем его охлаждают, переливают в мерную колбу и доводят водный объем реактива до 1 л.

Реактив Эрлиха . 0,7 г п-диметиламинобензальдегида растворяют в 150 мл концентрированной соляной кислоты, приливают к 100 мл воды и смешивают. Раствор должен быть бесцветным или слегка желтым. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стабилен.

Реактив Эрлиха . 1 г п-диметиламинобензальдегида растворяют в мерной колбе на 50 мл в 35 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют 8 мл 57%-ной хлорной кислоты и доводят до метки ледяной уксусной кислотой. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике не более недели.

Спиртовой раствор тимола (10%) . 10 г очищенного тимола растворяют в 100 мл 96˚ этилового спирта. Получение очищенного тимола проводят следующим образом. 100 г тимола растворяют в 100 мл 96˚ этилового спирта, фильтруют. К фильтрату добавляют 1 л холодной дистиллированной воды, сильно встряхивают и оставляют стоять на 20 мин. Фильтруют и кристаллы, оставшиеся на фильтре, промывают два раза холодной дистиллированной водой. Сушат вначале на фильтровальной бумаге, потом в течение 2-3 дней в эксикаторе над безводным хлористым кальцием до постоянного веса.

Стандартный раствор . Приготовление стандартного раствора проводится смешением двух растворов: 1) 0,0962 н раствор хлористого бария: 1,175 г кристаллического BaCl 2 ∙2H 2 O растворяют в 100 мл воды в мерной колбе. 2) 0,2 н раствор серной кислоты. Далее получают суспензию сульфата бария: 3 мл 0,0962 н раствора хлористого бария вливают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем 0,2 н раствором серной кислоты при температуре +10˚С (при этой температуре размеры частиц преципитированного сульфата бария дают относительно стабильный результат).

Субстратно-буферный раствор : в пробирку наливают 10 мл воды и добавляют 0,028 г L-глутамил-п-нитроанилина и 0,082 г хлорида натрия и, не переставая перемешивать, растворяют содержимое пробирки на кипящей водяной бане в течение 60 сек. Затем раствор охлаждают до 37˚С и добавляют 2,5 мл буферного раствора. Приготовленный раствор субстрата во время работы хранят в водяной бане при 37˚С. Неиспользованный раствор субстрата можно хранить в холодильнике в течение недели. Субстрат плохо растворим и при комнатной температуре выпадает в осадок. Поэтому перед употреблением выкристаллизовавшийся субстрат растворяют нагреванием в кипящей водяной бане. Нагревание и растворение субстрата можно повторять не более двух раз.

Субстратный раствор для определения АлАТ (раствор № 1) . Навески 29,2 мг α-кетоглутаровой кислоты и 1,78 г аланина (0,89 г α-аланина) взвешивают на аналитических весах и растворяют в 1 М растворе гидроксида натрия до полного растворения осадка (рН 7,4). Раствор переливают в колбу вместимостью 100 мл и доводят объем до метки 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,4). Добавляют 1 каплю хлороформа. Раствор хранят в холодильнике в замороженном состоянии.

Субстратный раствор для определения АсАТ (раствор № 2) . Навески 29,2 мг α-кетоглутаровой кислоты и 2,66 г α-аспарагиновой кислоты (1,33 г α-аспарагиновой кислоты) взвешивают на аналитических весах. Далее раствор готовят так же, как раствор № 1.

Субстратный раствор для определения глюкозофосфатизомеразы . Готовят мединалово-ацетатный буферный раствор с рН 7,4 (9,714 г ацетата натрия и 14,714 г мединала растворяют в воде и доводят объем до 500 мл). Смешивают 8,33 мл 0,03 М раствора двунатриевой соли глюкозо-6-фосфата с 25 мл мединалово-ацетатного буфера; добавляют к смеси 25 мл 0,1 М раствора соляной кислоты и доводят водой до 100 мл. Хранят на холоду.

Субстратный раствор для определения лактатдегидрогеназы . Смешивают по 1 мл 1 М раствора лактата натрия, 9 М раствора NаCl, 0,05 M Cl 2 , раствора НАД концентрации 10 г/л. Добавляют к содержимому по 2,5 мл 0,5 М раствора фосфатного буфера (рН 7,4) и 1 г/л раствора нитротетразолиевого синего. Перед употреблением к смеси прибавляют 0,25 мл раствора фенанзинметасульфата концентрации 1 г/л.

Субстратный раствор для определения фруктозобисфосфатальдолазы . 270 мг бариевой соли фруктозобисфосфата растворяют в 3,5 мл 1 М раствора соляной кислоты. Добавляют 1 мл 14%-ного раствора сульфата натрия, а выпавший при этом осадок удаляют центрифугированием. К надосадочной жидкости добавляют 1 каплю сульфата натрия. Появление мути свидетельствует о недостаточно полном осаждении ионов бария. В этом случае добавляют еще сульфата натрия и вновь центрифугируют. Центрифугат доводят 3%-ным раствором гидроксида натрия до рН 7,4-7,6, переносят в колбу вместимостью 25 мл и объем доводят до метки. Полученный раствор смешивают с 25 мл 0,56 М раствора гидразинхлорида, 25 мл 0,002 М раствора моноиодуксусной кислоты, 100 мл 0,5%-ного раствора карбоната натрия и 25 мл дистиллированной воды. Хранят в холодильнике.

Тимолово-вероналовый буфер . В мерной колбе на 100 мл смешивают 80 мл буферного раствора и 1 мл 10%-ного спиртового раствора тимола, встряхивают и доливают буферным раствором до метки. Величина рН должна составить 7,55.

о-Толуидиновый реактив . 0,15 г тиомочевины растворяют в 94 мл ледяной уксусной кислоты и смешивают с 6 мл перегнанного О-толуидина. Хранят в темной склянке.

Фенол, насыщенный водой . В 100 г перегнанного фенола добавляют 35 мл воды и перемешивают, слегка подогревая смесь для ускорения растворения фенола.

Фенолфталин, рабочий раствор . Готовят, растворяя 75 мг вещества в 15 мл 0,1 н раствора гидроксида натрия, раствор должен быть бесцветным или слегка розоватым, окрашенные растворы для работы не пригодны. Для увеличения стойкости реактива к нему добавляют 3 мг трилона, который, связывая соли тяжелый металлов, препятствует самоокислению фенолфталеина кислородом воздуха.

Фибрин . Фибрин бычьей крови отмывают от кровяных пигментов в проточной воде в течение нескольких дней до получения белого сгустка. Воду отжимают, а фибрин, залитый глицерином, хранят в плотно укупоренной банке. Перед употреблением фибрин отмывают от глицерина.

Фосфорно-ванилиновый реактив . 4 части (по объему) концентрированной ортофосфорной кислоты смешивают с 1 частью 0,6%-ного водного раствора ванилина. Реактив хранят в посуде из темного стекла при комнатной температуре.

Фруктозо-1,6-бисфосфат, натриевая соль . 2,0 мл 10%-ного раствора натриевой соли фруктозо-1,6-бисфосфата разводят в колбе на 25 мл водой до метки. Стабилен при условии хранения в холодильнике.

Цветной реактив на мочевину . Таблетку из набора для определения мочевины, содержащую диацетилмонооксим и тиосемикарбазид, растворяют при нагревании в колбе на 50 мл. Раствор устойчив в течение трех недель. Перед употреблением смешивают равные объемы приготовленного раствора и 9,6%-ного раствора серной кислоты.

Щелочной раствор β-глицерофосфата . В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 1 г β-глицерофосфата натрия и 0,85 г мединала, приливают около 30 мл дистиллированной воды, растворяют и доводят водой объем до метки. В другую мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 50 мл приготовленного раствора β-глицерофосфата, 2,8 мл 0,1 М раствора гидроксида натрия и доводят дистиллированной водой до метки (рН раствора 8,6). Наслаивают на жидкость около 3 мл толуола. Хранят раствор в холодильнике не более 10 дней.

Взятие крови, приготовление «тонкого мазка» и «толстой капли»

Движение бактерий. Строение жгутика, толщина, длина, химический состав. Приготовление фиксированных препара-тов и препаратов живых клеток микроорганизмов.

Для приготовления буферных растворов применяют реактивы квалификации х.ч. и ч.д.а., специально подготовленные. Подготовка реактивов проводится следующим образом.

Калий фосфорнокислый однозамещенный, KH 2 PO 4 , молекулярная масса 136,09. 100 г препарата растворяют при нагревании до кипения в 150 мл воды. Раствор фильтруют горячим. При постоянном перемешивании фильтрат охлаждают до 10 ºС. Затем добавляют 150 мл этилового спирта. Выделившиеся при постоянном перемешивании фильтрата кристаллы отфильтровывают на отсасывающей воронке и снова перекристаллизовавают в тех же условиях; кристаллы сушат до постоянной массы при 105…110 ºС. При наличии препарата с содержанием основного вещества в пределах 99,9…100,0 % предварительная подготовка вещества не проводится.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный,Na 2 HPO 4 ·12H 2 O, молекулярная масса 358,12. Существует два способа подготовки препарата.

а) 150 г препарата растворяют в 150 мл воды при нагревании до 100 0 С. Раствор фильтруют горячим и после охлаждения отфильтровывают выпавшие кристаллы. Перекристализацию повторяют при нагревании до 100 ºС. Перекристаллизованный препарат нагревают в фарфоровой чашке на водяной бане при непрерывном перемешивании до полного высыхания препарата. Полученную соль высушивают в эксикаторе над плавленым хлористым кальцием в течение суток. В перекристаллизованном препарате (Na 2 HPO 4 ·2H 2 O) проверяют содержание основного вещества. Для этого около 0,5000 г препарата растворяют в 50 мл воды, прибавляют 2…3 мл насыщенного раствора хлористого натрия и титруют 0,1 н раствором соляной кислоты в присутствии индикатора метилового красного. При необходимости вносят поправку в величину навески. 1 мл точно 0,1 н раствора соляной кислоты соответствует 0,0178 г Na 2 HPO 4 ·2H 2 O.

б) 75 г препарата растворяют в 250 мл воды, нагретой до 60 ºС. Раствор фильтруют горячим, фильтрат охлаждают при постоянном перемешивании до 10 ºС. Выпавшие кристаллы отфильтровывают на отсасывающей воронке и снова перекристаллизовывают в тех же условиях. Полученную соль сначала высушивают при температуре не выше 30 ºС в течение 24 ч, затем продолжают высушивать в сушильном шкафу при 50 ºС в течение 3…4 ч, и, наконец, при 120±5 ºС до постоянной массы, не допуская расплавления соли. После высушивания соль имеет состав Na 2 HPO 4 .

После подготовки реактивов готовят исходные растворы калия фосфорнокислого однозамещенного и натрия фосфорнокислого двузамещенного.

Навеску безводного калия фосфорнокислого однозамещенного KH 2 PO 4 массой 9,078 г растворяют в воде и объем раствора доводят до 1 л. Для стабилизации раствора добавляют 3…4 капли толуола.

Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенногоNa 2 HPO 4 ·12H 2 O, массой 11,876 г растворяют в воде и объем раствора доводят до 1 л. Для стабилизации раствора добавляют 3…4 капли толуола.

Из исходных растворов готовят фосфатные буферные растворы с рН от 4,94 до 9,18 в соответствии с таблицей А.2.

Таблица А.2 – Фосфатный буферный раствор с рН 4,94…9,18

рН	раствор Na 2 HPO 4 ·12H 2 O, мл	раствор KH 2 PO 4 , мл
4,94	1,0	99,0
5,29	2,5	97,5
5,59	5,0	95,0
5,91	10,0	90,0
6,24	20,0	80,0
6,47	30,0	70,0
6,64	40,0	60,0
6,81	50,0	50,0
6,98	60,0	40,0
7,17	70,0	30,0
7,38	80,0	20,0
7,73	90,0	10,0
8,04	95,0	5,0
8,34	97,5	2,5
8,67	99,0	1,0
9,18	100,0	0,0

Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 4058 |

Расчета рН буферных растворов осуществляется по уравнению Гендерсона – Гассельбаха:

– для кислотного буфера уравнение имеет вид

– для основного буфера

Уравнения показывают, что рН буферного раствора данного состава определяется отношением концентраций кислоты и соли или основания и соли, поэтому не зависит от разбавления. При изменении объема раствора концентрация каждого компонента изменяется в одинаковое число раз.

Буферная емкость

Способность буферных растворов сохранять постоянство рН ограничена. Т.е. прибавлять кислоту или щелочь, существенно не меняя рН буферного раствора, можно лишь в ограниченных количествах.

Величину, характеризующую способность буферного раствора противодействовать смещению реакции среды при добавлении кислот и щелочи, называют буферной ёмкостью раствора (В).

Буферная ёмкость измеряется количеством молей эквивалентов сильной кислоты или щелочи, добавление которой к 1 л буферного раствора изменяет рН на единицу.

Математически буферная ёмкость определяется следующим образом:

В по кислоте (моль/л ил ммоль/л):

,

где n(1/z HA) – количество моль эквивалентов кислоты, рН 0 и рН – рН буферного раствора до и после добавления кислоты, V Б – объем буферного раствора.

В по щелочи (моль/л или ммоль/л):

,

где n (1/z ВОН) – количество моль эквивалентов щелочи, остальные обозначения те же.

Буферная ёмкость зависит от ряда факторов:

1. От природы добавляемых веществ и компонентов буферного раствора. Т.к. некоторые вещества могут образовывать нерастворимые соединения или комплексы или давать другие нежелательные реакции с компонентами буферной системы, тогда понятие буферной ёмкости теряет смысл.

2. От исходной концентрации компонентов буферной системы.

Чем больше количества компонентов кислотно-основной пары в растворе, тем больше буферная ёмкость этого раствора.

Предел соотношения концентраций компонентов буферного раствора, при котором система все еще сохраняет свои свойства. Интервал рН = рК ± 1, называется зоной буферного действия системы. Это соответствует интервалу соотношения С соли /С к-ты от 1/10 до 10/1.

В к (крови) = 0,05моль/л; В к (плазмы) = 0,03 моль/л; В к (сыв.крови) = 0,025 моль/л

Буферные системы крови

Особенно большое значение буферные системы имеют в поддержании кислотно-основного равновесия организмов. Значение рН большей части внутриклеточных жидкостей находится в интервале от 6,8 до 7,8.

Кислотно – основное равновесие в крови человека обеспечивается гидрокарбонатной, фосфатной, белковой и гемоглобиновой буферными системами. Нормальное значение рН плазмы крови 7,40 ± 0,05.

Гемоглобиновая буфернаясистемана 35% обеспечивает буферную емкость крови: . Оксигемоглобин является более сильной кислотой, чем восстановленный гемоглобин. Оксигемоглобин обычно бывает в виде калиевой соли.

Карбонатная буферная система: по своей мощности занимает первое место. Она представлена угольной кислотой (Н 2 СО 3) и бикарбонатом натрия или калия (NaНСО 3 , КНСО 3) в пропорции 1/20. Бикарбонатный буфер широко используется для коррекции нарушений кислотно-основного состояния организма.

Фосфатная буферная система . Дигидрофосфатобладает свойствами слабой кислоты и взаимодействует с поступившими в кровь щелочными продуктами. Гидрофосфат имеет свойства слабой щелочи и вступает в реакцию с более сильными кислотами.

Белковая буферная системаосуществляет роль нейтрализации кислот и щелочей благодаря амфотерным свойствам: в кислой среде белки плазмы ведут себя как основания, в основной – как кислоты:

Буферные системы имеются и в тканях, что способствует поддержанию рН тканей на относительно постоянном уровне. Главными буферами тканей являются белки и фосфаты. Поддержание рН осуществляется также с помощью легких и почек. Через легкие удаляется избыток углекислоты. Почки при ацидозе выделяют больше кислого одноосновного фосфата натрия, а при алкалозе – больше щелочных солей: двухосновного фосфата натрия и бикарбоната натрия.

Примеры решения задач

Решение:

Рассчитываем рН кислотного буферного раствора по формуле , тогда

Ответ: 5,76

Решение:

Рассчитываем буферную емкость по формуле:

Ответ: 0,021 моль/л

Пример 3.

Буферный раствор состоит из 100 мл 0,1моль/л уксусной кислоты и 200 мл 0,2моль/л ацетата натрия. Как изменится рН этого раствора, если к ней добавить 30 мл 0,2моль/л раствора гидроксида натрия.

Решение:

Рассчитываем рН буферного раствора по формуле:

При добавлении к буферному раствору NaOH увеличивается количество соли и уменьшается количество кислоты в буферном растворе:

0,006 0,006 0,006

СH 3 COOH + NaOH = CH 3 COONa + H 2 O

Рассчитываем n (NaOH) = 0,03 л · 0,2 моль/л = 0,006 моль, следовательно в буферном растворе количество кислоты уменьшается на 0,006 моль, а количество соли увеличится на 0,006 моль.

Рассчитываем рН раствора по формуле:

Отсюда: рН 2 – рН 1 = 5,82 – 5,3 = 0,52

Ответ: изменение рН буферного раствора = 0,52.

Задачи для самостоятельного решения

4. На титрование 2 мл крови для изменения рН от начального значения (7,36) до конечного значения (7,0) потребовалось добавить 1,6 мл 0,01 М раствора HCl. Рассчитайте буферную емкость по кислоте.

5. Сколько моль ацетата натрия необходимо добавить к 300 мл уксусной кислоты, чтобы понизить концентрацию ионов водорода в 300 раз (К дис (сн 3 соон) = 1,85.10 -5).

6. При биохимических исследованиях используют фосфатный буфер с рН= 7,4. В каком соотношении надо смешать растворы гидрофосфата натрия и дигидрофосфата натрия с концентрацией по 0,1 моль/л каждый, чтобы получить такой буферный раствор (рК(Н 2 РО 4 -) = 7,4).

7. Какие нарушения КОС наблюдаются при следующих показателях: рН крови = 7,20, Рсо 2 = 38 мм рт. ст., БО = 30 ммоль/л, СБО = -4 ммоль/л. Как устранить данное нарушение КОС?

Тестовые задания

Фосфатно-солевой промывочный буфер с Твин-20 для иммуногистохимии - это концентрат (20х), который после разбавления используется для промывки стёкол от реагентов и кратковременного хранения иммуногистохимических образцов между процедурами. После разбавления готовый к применению 0,01 М раствор имеет рН 7,4±0,1. Использование данного фосфатно-солевого буфера позволяет не только обеспечить качественную промывку, но и сохранить морфологические характеристики применяемых антител и их эпитопов, что облегчает специфическое связывание, необходимое для иммуногистохимической реакции. Добавление Твин-20 к фосфатно-солевому буферу способствует более эффективной промывке и предотвращает появление неспецифического окрашивания.

Наши преимущества:

На данный момент мы сотрудничаем с ведущими зарубежными производителями лабораторных реактивов. Нашими клиентами являются как негосударственные, так и государственных учреждения, в том числе медицинские организации Москвы и других городов России. Для постоянных клиентов предусмотрена система скидок.